DB23∕T 3733-2024 红松无性系SSR鉴别技术规程(黑龙江省)
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ID： |
2FD2B7E180AC407FBF0028D0007F1431 |
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文件大小(MB)： |
0.51 |
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9 |
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文件格式： |
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日期： |
2024/10/20 |
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ICS 65.020.01,CCS B 60,DB23,黑龙江省地方标准,DB23/T 3733—2024,红松无性系SSR鉴别技术规程,2024-8-30发布 2024-9-29实施,黑龙江省市场监督管理局 发布,DB23/T 3733—2024,前 言,本文件依据GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草,请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任,本文件由黑龙江省林业和草原局提出,本文件由黑龙江省林业和草原局标准化技术委员会归口,本文件起草单位：东北林业大学、佳木斯市孟家岗林场、苇河林业局青山林木种子园、宁安市渤海林木种子园、五常市宝龙店种子林场、鹤岗市林木良种繁育中心,本文件主要起草人：张含国、闫平玉、张 磊、孙国飞、潘凤刚、李金泉、石宝英、胡振宇、曹振宇、李志新,DB23/T 3733—2024,1,红松无性系SSR鉴别技术规程,1 范围,本文件规定了红松（Pinus koraiensis Siebold & Zucc.）无性系SSR鉴别技术中技术原理、仪器设备及试剂、溶液配制、操作程序、数据记录与统计、判定规则及档案管理等要求,本文件适用于红松无性系的SSR指纹数据采集及品种鉴定,2 规范性引用文件,下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件,GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法,3 术语和定义,下列术语和定义适用于本文件,3.1 核心引物,快速、准确、稳定鉴定无性系的SSR 引物,3.2 补充引物,核心引物检测出不同无性系差异位点数小于 2 时可选择的引物,4 缩略语,DNA：DeoxyriboNucleic Acid 脱氧核糖核酸,PCR：Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应,SSR：Simple Sequence Repeats 简单重复序列,EDTA：Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸,TEMED：N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 四甲基乙二胺,dNTP：deoxy-ribonucleoside triphosphate 脱氧核糖核苷三磷酸,PAGE：Polyacrylamide Gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳,CTAB：Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide十六烷基三甲基溴化铵,TBE：Tris-Borate-EDTA buffer -硼酸-乙二胺四乙酸二钠缓冲液,5 技术原理,5.1 遗传差异,由于不同红松无性系遗传组成不同，基因组DNA中SSR的重复次数存在广泛差异,DB23/T 3733—2024,2,5.2 检测技术,简单重复序列差异可以通过PCR扩增及电泳方法进行检测，从而区分不同红松无性系,6 仪器设备及试剂,6.1 主要仪器设备,PCR扩增仪；电泳仪（具有恒电压、恒电流功能）；垂直电泳槽及配套的制胶附件；水平电泳槽及配套的制胶附件；高速离心机（最大离心力大于15 000 g）；水平摇床；电子天平（精度为0.1 mg）；微量移液器（规格分别为2.5 μL、20 μL、200 μL、1 000 μL，连续可调）；磁力搅拌器；超微量分光光度计；微波炉；高压灭菌锅；水浴锅；超低温冰箱（最低温度-80 ℃）；制冰机；凝胶成像系统,6.2 主要试剂,十六烷基三乙基溴化铵；三氯甲烷；异丙醇；异戊醇；乙二胺四乙酸二钠二水合物；三羟甲基氨基甲烷；氢氧化钠；浓盐酸；10×缓冲液（含Mg2+ 25 mmol/L）；dNTP；DNA聚合酶；琼脂糖；DNA分子量标准；核酸染色剂；去离子甲酰胺；溴酚蓝；二苯甲青；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；硼酸；无水乙醇；过硫酸铵；硝酸银；甲醛,7 溶液配制,7.1 DNA提取溶液,0.5mol/L HCI溶液：25 mL浓盐酸（36%~38%），加水定容至500 mL,TE：1 mol/L Tris-HCl溶液 5 mL，0.5 mol/L EDTA溶液 1 mL，加0.5mol/L HCI溶液调pH至8.0，定容至500 mL,0.5 mol/L EDTA 溶液：186.1 g 乙二胺四乙酸二钠二水合物溶于800 mL水中，氢氧化钠调pH至8.0，定容至1 L，高压灭菌,1mol/L Tris-HCI 溶液：60.55 g 三羟甲基氨基甲烷溶于适量水中，加0.5mol/L HCI溶液调pH至8.0定容至500 mL，高压灭菌,CTAB提取液：81.7 g氯化钠和20 g CTAB溶于适量水中，加1 mol/L Tris-HCl溶液 100 mL，0.5 mol/L EDTA 40 mL，定容至1 L，4℃贮存,7.2 PCR扩增溶液,SSR引物：用超纯水分别配制前引物和后引物终浓度均10 μmol/L的工作液,加样缓冲液（6×）：去离子甲酰胺49 mL，0.5 mol/L的EDTA溶液1 mL，溴酚蓝0.125 g，二甲苯青0.125 g,7.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液,30% PAGE胶：丙烯酰胺290 g，甲叉双丙烯酰胺10 g，定容至1 L,7% PAGE胶：10×TBE 50 mL，30% PAGE胶233.3 mL，定容至1 L,25%过硫酸铵溶液：0.25 g过硫酸铵溶于1 mL超纯水中,TBE（10×）：三羟甲基氨基……
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